Система визуализации для конфокальной микроскопии от Thorlabs
Система визуализации для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) от компании Thorlabs позволяет исследователям расширить возможности стандартных прямых и инвертированных микроскопов (см. рис.1). Все модульные компоненты системы разработаны компанией Thorlabs для максимального удобства использования и легкой интеграции с существующими системами обработки изображений, а также для получения высококачественных изображений. Эти системы обеспечивают полную интеграцию практически с любым микроскопом, прямым или инвертированным (не входит в комплект), при условии доступа к промежуточной плоскости изображения (например, порт камеры) через C-Mount. Управление системой осуществляется с помощью программного обеспечения ThorImageLS™ (входит в комплект), которое имеет интуитивно понятный графический интерфейс пользователя и обеспечивает быстрый просмотр и запись данных.
Рис. 1. Система визуализации для конфокальной микроскопии от компании Thorlabs, установленная на инвертированный микроскоп
Видео ниже демонстрирует четырехканальную систему визуализации для конфокальной микроскопии, установленную на микроскоп Nikon FN1. Данная система оснащена лазерным модулем с 4 встроенными источниками и 4-х канальным модулем детектирования с ФЭУ стандартной чувствительности. Гальвано-резонансная сканирующая головка обладает 2 оптоволоконными входами и моторизированным колесом с 16 пинхолами.
Видео 1. Четырехканальная система визуализации для конфокальной микроскопии
Конфигурация системы
Конфокальная система способна регистрировать до 400 кадров в секунду при разрешении 512 х 32 пикселя. Лазерный модуль включает в себя до четырех источников света с длинами волн возбуждения в диапазоне: 405 - 660 нм, позволяя визуализировать широкий спектр флуоресцентных красителей. Детектор может использовать от двух до четырех каналов детектирования для визуализации образцов с несколькими метками.
Предварительно сконфигурированные комбинации лазерных длин волн и наборов фильтров подобраны специально для работы с популярными флуорофорами.
Ниже представлена таблица №1, описывающая особенности и преимущества конфокальной системы.
Таблица 1 - Особенности и преимущества использования конфокальной системы
|
Особенность |
Преимущества |
|
Устанавливается на C-Mount разъемы камеры с доступом к промежуточной плоскости изображения |
Преобразование стандартного микроскопа исследовательского класса в конфокальную сканирующую систему |
|
Гальвано-резонансная сканирующая головка:
|
Быстрая регистрация изображений живых систем |
|
Высокие частоты кадров уменьшают эффект фототоксичности и нежелательного эффекта фотообесцвечивания |
|
|
Максимальное разрешение сканирования:
|
Получение изображений с высоким разрешением при использовании сканирующего объектива с широким полем зрения |
|
Объектив для сканирования Thorlabs:
|
Для получения изображений больших объектов требуется меньше изображений для сшивания. |
|
Настраиваемый модуль детектора:
|
Визуализация образцов с разными метками |
|
Быстро и легко менять эмиссионные фильтры для оптимизации светосбора для вашего образца |
|
|
Выбор либо стандартных многощелочных, либо GaAsP высокочувствительных ФЭУ |
ФЭУ с многощелочным фотокатодом отлично подходят для образцов с большим динамическим диапазоном |
|
Использование ФЭУ с высокой чувствительностью для визуализации слабофлуоресцентного изображения или живых образцов с низкой фоточувствительностью |
|
|
Лазерный источник света, имеющий до 4 длин волн возбуждения (все источники содержат синий лазер с длиной волны 488 нм) |
Выбор требуемой длины волны лазерного излучения |
|
Подбор комбинаций длин волны для популярных флуорофоров |
|
|
16-позиционное моторизированное колесо фильтров с круглым пинхолом |
Выберите размер, который позволит получить максимальную пропускную способность без уменьшения разрешения |
|
Круглые пинхолы для оптимизации сбора сигнала в фокусе |
|
|
Собственное ПО ThorImageLS ™ |
Управление микроскопом, автоматизированный сбор данных и анализ изображений |
Ход лучей в оптической системе
Рис. 2. Путь света от лазерного источника к сканирующей головке и из сканирующей головки в ФЭУ
Четырехканальная конфокальная система
Подробно рассмотрим элементы системы для конфокальной микроскопии, помеченные цифрами на рис. 3
Рис. 3. Четырехканальная конфокальная система (микроскоп не входит в комплект поставки)
1. Конфокальная сканирующая головка
Конфокальная сканирующая головка состоит из трех основных компонентов (см. рис.4):
А) Высокоскоростной Гальвано-Резонансный сканер для видимого (SCAN-VIS) или УФ + видимого (SCAN-UV) диапазонов;
B) Моторизованное колесо с круглыми пинхолами;
C) Объектив сканирования с полем зрения 25 мм.
Рис. 4. Сканирующая головка конфокальной системы Thorlabs
Сканер может быть подключен практически к любому прямому или инвертированному микроскопу с доступом к промежуточной плоскости изображения через порт C-Mount (например, порт камеры) до тех пор, пока 100% света направлены на этот порт.
Свет от лазера попадает в головку сканирования отражается от гальвано-резонансных сканирующих зеркал, проходит через блок фильтров и выходит через сканирующий объектив с широким полем зрения (см. рис.5).
Рис. 5. Оптическая схема, показывающая путь света через сканирующую головку
Затем свет поступает в микроскоп и возбуждает флуорофоры в образце. Полученное флуоресцентное излучение проходит обратно через объектив с широким полем зрения и отражается от гальвано-резонансного сканера в колесо с пинхолами. Колесо с пинхолами соединено с детекторными модулями посредством оптоволокна через SMA разъем.
|
Моторизованное колесо пинхолов 
Моторизированное колесо – стеклянная пластина с 16 круглыми пинхолами диаметром от 25 мкм до 2 мм. Все пинхолы имеют высокую степень допуска. Это гарантирует сохранение юстировки при повороте колеса. Выбор оптимального размера пинхола очень важен для получения конфокальных изображений с хорошим отношением сигнал/ шум и разрешением. Часто необходимо согласовать размер пинхола с числовой апертурой объектива. В других случаях, например, при работе с тонкими образцами, которые дают меньше света вне фокальной плоскости, может быть использован больший размер пинхола для повышения пропускной способности. Размер пинхола выбирается в качестве дополнения к общей числовой апертуре объектива, что позволяет адаптировать конфокальную систему к условиям эксперимента. Как показано справа, круглый конфокальный пинхол является идеальной формой для максимального пропускания света в фокальной плоскости при оптимизации отклонения света вне фокуса, который создается выше и ниже слоя сканируемого образца. В результате, системы, использующие круглые пинхолы, позволяют обеспечить более высокое разрешение и отношение сигнал/шум. |
|
Объектив с широким полем зрения
В дополнение к объективу с большим угловым диапазоном, который используется в резонансном сканере, инженеры Thorlabs разработали сканирующий объектив с широким полем обзора.
Объектив имеет отличную коррекцию хроматических аберраций в диапазоне от 405 до 1100 нм (просветляющее покрытие: от 405 до 750 нм), превосходную плоскостность поля и очень низкий уровень искажений в пределах поля зрения. Такой широкий диапазон длин волн добавляет системе функциональности, обеспечивая возможность использования лазерных источников до 400 нм.
2. Лазерный источник света
Твердотельный лазерный модуль с несколькими источниками позволяет минимизировать затраты на техническое обслуживание системы. Каждый источник, соединен с оптоволокном, которые объединяются в общий волоконный ответвитель. Такая конструкция гарантирует сохранение юстировки системы и полной мощности лазеров. Для обеспечения дополнительных функциональных возможностей модуль оснащен дополнительным волоконным выводом для лазерного диода с длиной волны 405 нм.
Оптоволоконный вывод для излучения источников модуля - одномодовое волокно с разъемом FC/PC. Излучение разных выводов модуля объединяется после расширителя луча в модуле сканирующей головки. После этого в оптический путь можно ввести излучение УФ лазера с диаметром пучка 4 мм, что повышает стабильность и поддерживает цветовую коррекцию системы.
Управление лазерным источником (см.рис.6) осуществляется с помощью единого USB интерфейса, что позволяет пользователю включать и выключать каждый лазер, а также контролировать его интенсивность.
Рис. 6. Четырехканальный лазерный источник света
Доступные комбинации длин волн лазерного источника и наборы фильтров, входящие в набор, перечислены в таблице 2.
Таблица 2 - Параметры лазерного источника света
|
Параметры лазерного источника света |
||||||
|
Лазерный источник света #a |
Длины волн возбуждения |
Запирающие фильтры, входящие в комплект |
||||
|
УФ |
Синий |
Зеленый/Оранжевый |
Красный |
Запирающие фильтры Пропускная способность) |
Длина волны отсечки дихроичного длинноволнового фильтра |
|
|
CMLS-A |
- |
488 нм |
- |
642 нм |
525 нм /45 нм и 635 нм/Длинноволновый |
562 нм |
|
CMLS-Bb |
405 нм |
488 нм |
- |
642 нм |
447 нм /60 нм, 512/25 нм и 635 нм/ Длинноволновый |
495 нм и 538 нм |
|
CMLS-C |
- |
488 нм |
532 нм |
642 нм |
513 нм 17 нм, 582 нм /75 нм и 635 нм Длинноволновый |
538 нм и 649 нм |
|
CMLS-D |
- |
488 нм |
561 нм |
642 нм |
525 нм/45 нм, 607 нм/36 нм и 535 нм/ Длинноволновый |
562 нм и 649 нм |
|
CMLS-Eb |
405 нм |
488 нм |
532 нм |
642 нм |
447 нм/60 нм, 513 нм/17 нм, 582 нм/75 нм, and 635 нм/ Длинноволновый |
495 нм, 538 нм, и 649 нм |
|
CMLS-Fb |
405 нм |
488 нм |
561 нм |
642 нм |
447 нм/60 нм, 525 нм/45 нм, 607 нм/36 нм и 635 нм/ Длинноволновый |
495 нм, 562 нм, и 469 нм |
|
CMLS-Gb |
405 нм |
488 нм |
588 нм |
642 нм |
447 нм/60 нм, 525 нм/45 нм, 615 нм/24 нм и 635 нм/ Длинноволновый |
495 нм, 605 нм, и 649 нм |
|
CMLS-H |
- |
488 нм |
- |
660 нм |
525 нм/39 нм и 697 нм/58 нм |
562 нм |
|
CMLS-I |
- |
488 нм |
- |
- |
525 нм/45 нм |
- |
|
CMLS-J |
- |
488 нм |
532 нм |
- |
512 нм/25 нм и 582 нм/75 нм |
538 нм |
а. Лазерные источники не поставляются отдельно от конфокальной системы
b. Эти источники совместимы только со сканирующей головкой, которая имеет второй входной волоконный порт для УФ источника света.
3. Фильтры
Каждая конфокальная система включает в себя набор запирающих фильтров, которые блокируют попадание света лазерных источников на ФЭУ и обеспечивают полосу пропускания на длинах волн флуоресценции стандартных флуорофоров. Точная конфигурация определяется длинами волн лазеров в вашей конфокальной системе. На рис. 7. продемонстрирован специальный куб для быстрой смены фильтров.
Рис. 7. Наборы фильтров устанавливаются в специальный куб для быстрой замены
Несколько общих конфигураций и совместимых флуорофоров приведены ниже.
Рис. 8. Сплошные линии на графике показывают полосы пропускания фильтров, а заштрихованные участки нормированный спектр излучения для флуорофоров
Таблица 3 - Набор запирающих фильтров
|
Возбуждение |
|||||
|
Лазерный источник света |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
|
Длина волны лазера |
405 нм |
488 нм |
561 нм |
642 нм |
|
|
Излучение |
|||||
|
Эмиссионные фильтры (фильтры, входящие в комплект, определяются конфигурацией лазера) |
Полосовой фильтр (центральная длина волны/ ширина пропускания, Tср) коэффициент пропуская
|
447 нм/60 нм, >93% (только с лазерным источником света в 405 нм) 525 нм/50 нм, >93% 593 нм/46 нм, >94% |
|||
|
Длинноволновый фильтр |
660 нм, Tср >93% (до 1200 нм) |
||||
График и таблица, представленные выше, демонстрируют набор эмиссионных фильтров с наиболее часто запрашиваемыми четырьмя лазерными источниками света (405 нм, 488 нм, 561 нм и 642 нм). Спектры излучения четырех совместимых флуорофоров накладываются на профили пропускания фильтров.
Вторая наиболее распространенная конфигурация с четырьмя лазерными источниками света состоит из лазера с длиной волны 532 нм, вместо 561 нм. Данная длина волны необходима для образцов, которые помечены ярко-оранжевым флуоресцентным красителем (TRITC).
Для получения такой длины волны, два полосовых фильтра с центральной длиной волны 525 нм и 593 нм заменяются на более узкий полосовой фильтр (ширина полосы пропуская 25 нм) с центральной длиной волны 512 нм и более широкий полосовой фильтр (ширина полосы пропуская 75 нм) с центральной длиной волны 582 нм.
4. Детектор
Для получения дополнительных возможностей можно увеличить количество ФЭУ с двух до четырёх. Перед каждым ФЭУ находится быстрозаменяемое дихроичное зеркало и эмиссионный фильтр (включая наборов фильтров, см. таблицу выше).
Детекторный модуль может работать со стандартным чувствительным многощелочным ФЭУ или высокочувствительным ФЭУ на GaAsP с низким уровнем шума. Стандартная чувствительность многощелочного ФЭУ обеспечивает низкий уровень шума изображения с высоким динамическим диапазоном, который подходит для большинства применений связанных с медициной, биологией и промышленностью. Для слабо флуоресцентных или сильно фоточувствительных образцов, предлагается высокочувствительный ФЭУ на GaAsP с термоэлектрическим охлаждением. При любом выборе, коэффициент усиления детектора, а также динамический диапазон цифрового преобразователя регулируется с помощью программного обеспечения ThorImageLS.
На рис.9 показан четырехканальный модуль со стандартной чувствительностью ФЭУ.
Рис. 9. Четырехканальный модуль со стандартной чувствительностью ФЭУ
В комплект поставки представленной системы визуализации для конфокальной микроскопии входит компьютер с 24 дюймовым монитором (см. рис.10). Стандартные конфигурации используют 64-битный системный блок от Dell с установленным программным обеспечением ThorImageLS. Для систем, требующих более высокой вычислительной мощности, предлагается сервер Superlogics. Включенное программное обеспечение ThorImageLS, предоставляет комплексное решение для управления микроскопом, автоматизированного сбора данных и просмотра изображений.
Рис. 10. Системный блок от Dell (32 или 64 бита) или от Superlogics (64 бит) с установленным ПО ThorImageLS и 24-х дюймовым монитором для сбора и анализа данных
Изображения, полученные с помощью системы визуализации для конфокальной микроскопии от Thorlabs
Рассмотрим изображения, полученные с помощью представленной системы.
Рис. 11.Изображение почки мыши
Большое изображение справа было создано путем объединения большого количество отдельных изображений, полученных с помощью системы визуализации для конфокальной микроскопии. Выделен и увеличен один фрагмент, демонстрирующий уровень контрастности и детализации, присутствующий в каждом изображении.
Рис. 12. Фотография объемной проекции насекомого, полученная с помощью конфокальных изображений при автофлюоресценции. Изображение показывает часть его живота и ног. (Размер объекта: 330 мкм х 330 мкм, Длина волны возбуждения: 488 нм, Длина волны эмиссии (обнаружения): 500 - 550 нм, Иммерсионный водяной объектив: 60X, NA 1.0)
Рис. 13. Живые нейроны гиппокампа, окрашенные флуоресцентным красителем (Lucifer Yellow)
Программное обеспечение для сбора данных
ПО ThorImageLS для получения и анализа изображений было разработано совместно с конфокальной микроскопической системой.
Для оптимизации рабочего процесса интерфейс отображает только параметры, необходимые для каждой серии сканирования (например, Z серии для объемного сканирования или временные серии для получения динамики). Каждый программный режим прост в использовании, позволяя регистрировать изображение по щелчку мыши.
Все экспериментальные данные сохраняются в формате OME-TIFF без потерь. Изображение, сохраненные в стандартном формате, совместимы с программой ImageJ и другими подобными программами. Каждый файл сохраненного изображения содержит метаданные, позволяющие масштабировать в ImageJ изображения при открытии их для обзора.
ThorImageLS также предоставляет инструмент обзора для просмотра ранее полученных изображений, позволяя проводить дальнейший анализ.
Используйте ползунки, чтобы просмотреть последовательность сбора данных во времени, визуализировать плоскости изображения вдоль оси Z или выбрать одно изображение из всего потока. Полученные Z серии, временные ряды или потоки изображений могут быть напрямую экспортированы в видео формата AVI с помощью встроенного видеоредактора в ThorImageLS.
Особенности:
- Возможность регулировки мощности лазера (от 1 до 4-х);
- Выбор диаметра пинхола (16 различный вариантов);
- Выбор площади сканирования и размер пикселя изображения;
- Присвоение цвета к каждому каналу обнаружения;
- Формирование 3D объекта путем реконструкции серии изображений вдоль оси Z;
- Создание видеоролика с помощью встроенного видеоредактора;
- Сохранение данных без потерь в формате OME-TIFF совместимый с ImageJ и другими популярными программами для анализа изображений;
- Наличие метаданных для корректного масштабирования в ImageJ.
Рис. 14. Интерфейс ПО ThorImageLS
